- 完整的多光子FLIM系统，包括显微镜和激光器
- 现有传统显微镜的多光子 FLIM 升级
- 由钛:萨或飞秒光纤激光器激发
- 提供组合式多光子/共焦系统
- 激光控制集成在系统软件中
- 激发波长从 650 纳米到 1200 纳米不等
- 通过快速振镜扫描
- 两个非扫描检测通道
- 通过二向色或偏振分光镜进行通道分离
- 通过bh 的多维 TCSPC 流程进行记录
- 两个完全并行的 TCSPC FLIM 通道
- 时间通道宽度低至 203 fs
- 超快、超灵敏探测器
- 前所未有的时间分辨率
- 检测寿命小于 10 ps
- 接近理想的光子效率
- 卓越的寿命可重复性
- 快速在线 FLIM
- 百万像素 FLIM，2048 x 2048 像素
- 精确 FLIM，4096 个时间通道
- 马赛克 FLIM
- Z-Stack FLIM
- 快速时间序列累积
- 多波长 FLIM
- 同步 FLIM / PLIM
- 集成式电动样品台
- 通过bh SPCImage NG进行数据分析
- GPU 超快速处理
- 时域分析与相位图相结合
- 通过相位图或二维直方图进行图像分割
- 衰减曲线的 MLE 拟合
- 自动 IRF 建模
- 无需记录 IRF
说明
DCS-120 MP 系统采用飞秒激光脉冲多光子激发、振镜快速扫描、共焦检测以及bh 的多维 TCSPC 技术进行荧光寿命成像。它以前所未有的时间分辨率、前所未有的重现性、高空间分辨率、高灵敏度和接近理想的光子效率记录荧光寿命图像。对荧光寿命的检测可低至 10 ps；衰变数据可解析为宽度低至 203 fs 的 4096 个时间通道。像素格式可增至 2048 x 2048。
为了利用多光子激发的高穿透深度，DCS-120 MP 采用了非扫描检测。 MP 系统可用于尼康、蔡司和奥林巴斯的倒置显微镜。由于其光束扫描速度快、灵敏度高，DCS-120 系统可用于活细胞成像。DCS-120 的功能包括在两个完全平行的波长通道中同时记录 FLIM 或稳态荧光图像、激光波长复用、时间序列 FLIM、时间序列记录、Z-Stack FLIM、磷光寿命成像（PLIM）、荧光寿命瞬时扫描（FLITS）和 FCS 记录。应用重点是荧光团与其分子环境相互作用而产生的寿命变化。典型应用包括离子浓度测量、FRET 实验、代谢成像、快速生理效应成像和植物生理学。
DCS-120 MP 多光子荧光成像系统可配备钛蓝宝石激光器和飞秒光纤激光器。两种版本如下图左右所示。钛-蓝宝石激光器系统具有可调谐性和高激光功率的优点。高功率允许使用 AOM（声光调制器）进行软件控制的强度调节、快速光束消隐和像素同步开/关调制，以同时进行 FLIM / PLIM。另一方面，光纤激光系统结构紧凑，易于使用，几乎无需维护。缺点是波长固定为 780 纳米。不过，缺乏可调性并不像人们通常认为的那样是个问题：大多数荧光团的双光子吸收带都很宽，足以在此波长下激发它们。此外，780 纳米也是激发 NADH 的最佳波长。因此，光纤激光系统几乎是理想的多光子代谢-荧光成像系统。
规格
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选定规格 |
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原理 |
快速振镜激光扫描激发、非扫描检测 (NDD) 和 bh 的多维 TCSPC FLIM 技术 |
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激发 |
fs脉冲激光，自由光束或光纤耦合 |
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扫描速率，像素停留时间 |
低至约 1 μs/pixel |
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一般操作模式 |
TCSPC FLIM：
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扫描头 |
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光学原理 |
快速振镜激光扫描激发 |
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激光输入 |
两个独立输入，光纤耦合或自由光束 |
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光学激光功率控制 |
连续 ND 滤光片轮控制 |
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激光输入要求 |
准直自由光束，或带 12 毫米直径准直器的光纤耦合光束。光束直径为 1 至 2 毫米 |
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与显微镜连接 |
连接显微镜左侧端口或顶部端口的适配器 |
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扫描控制 |
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原理 |
硬件控制精确激光扫描，快速回扫，实现快速采集 |
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帧尺寸 |
帧扫描 16 x 16 至 4096 x 4096 像素，行扫描 16 至 4096 像素 |
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X 扫描 |
连续扫描或逐个像素扫描、 |
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Y 扫描 |
逐行扫描 |
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电子激光功率控制 |
软件控制带有模拟调制输入的激光器或控制单独的 AOM。 |
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激光复用 |
帧、行、像素和像素内。需要软件控制激光功率。 |
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光束消隐 |
飞返期间和扫描停止时。需要软件控制激光功率。 |
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帧频/扫描速度 |
自动选择最快速率或手动选择 |
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扫描区域定义 |
交互式扫描区域选择、硬件缩放 + 偏移。 |
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快速预览功能 |
是 |
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光束驻留功能 |
是，交互式测量点选择。 |
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TCSPC 系统 |
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TCSPC / FLIM 模块 |
SPC-180NX |
SPC-QC-104 |
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并行 TCSPC / FLIM 通道数 |
典型值2，最多4 |
典型值2，最多3 |
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电气时间分辨率 |
1.6 ps RMS / 3.5 ps FWHM |
16 ps RMS / <39 ps FWHM |
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定时精度 / |
1.1 ps |
11 ps |
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最小时间通道宽度 |
405 fs |
4 ps |
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饱和计数率 |
12 MHz |
40 MHz，活动通道共享。 |
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激光复用同步 |
最多 4 个激光波长 |
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记录多波长数据 |
通过路由功能在 16 个通道中同时进行 |
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实验触发功能 |
TTL，用于 Z-Stack FLIM 和显微镜控制的时间序列 |
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TCSPC 系统的操作模式 |
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软件 |
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数据采集软件 |
bh SPCM、用于集成外部设备的 bh LabVIEW |
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扫描仪控制软件 |
集成在 SPCM 中，bh LabVIEW 用于集成外部设备 |
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操作系统 |
Windows 10 / 11 64 位 |
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数据分析软件 |
bh SPCImage NG |
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数据分析原理 |
MLE 拟合（GPU 辅助处理） |
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函数模型 |
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IRF 建模 |
拟合衰变数据的合成 IRF 函数、从数据中自动提取 IRF 或测量 IRF |
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激发源 |
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多光子 FLIM |
自由光束或光纤耦合飞秒脉冲激光器，单一波长或可调波长 |
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可选 |
共焦 FLIM，系统中可耦合一个额外的 BDS-SM ps 二极管激光器。 |
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探测器 |
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NDD 探测器 |
直接耦合到显微镜后端口 |
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可选 |
共焦检测器，直接耦合到扫描头 |
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标准探测器 |
HPM-100-40 混合探测器，带 GaAsP 阴极，250 至 720 nm，最适合与 ns 寿命染料一起使用 |
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可选 |
HPM-100-06 检测器，<20 ps FWHM IRF 宽度，220 至 650 nm，最适合用于 ps 寿命自发荧光研究 |
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可选 |
HPM-100-50 检测器，波长 400 至 900 nm，最适合长波长荧光研究 |
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可选 |
MW-FLIM GaAsP 多波长探测器 |
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下载
文件
bh FLIM 系统的应用领域是分子成像。典型的应用包括离子浓度、pH 值或局部粘度成像，通过 FRET 进行蛋白质相互作用实验，以及通过 NADH 和 FAD 的荧光衰减结合氧气测量进行代谢成像。在这些应用中，bh FLIM 系统具有高灵敏度、高时间分辨率、高定时稳定性，并能将多指数衰减曲线分解为各个组成部分。其他优势还包括能够记录毫秒级的快速生理效应 FLIM，以及同时记录多个激发和发射波长。
应用
应用说明
- Recording the Instrument Response Function of a Multiphoton FLIM System
- Non-Descanned FLIM Detection in Multiphoton Microscopes
- Microsecond Decay FLIM: Combined Fluorescence and Phosphorescence Lifetime Imaging
- DCS-120 Confocal Scanning FLIM System: Two-Photon Excitation with Non-Descanned Detection
- Mosaic FLIM: New Dimensions in Fluorescence Lifetime Imaging
- Simultaneous Phosphorescence and Fluorescence Lifetime Imaging by Multi-Dimensional TCSPC and Multi-Pulse Excitation
- DCS-120 FLIM System Records X-Y Mosaics
- DCS-120 MP System Records Multiphoton FLIM and PLIM
- Two-Photon FLIM with a Femtosecond Fibre Laser
- Two-Photon FLIM of Mushroom Spores Reveals Ultra-Fast Decay Component
- High-Resolution Measurement of NADH and FAD Fluorescence Decay with the DCS-120 MP
- Two-Photon FLIM of Pollen Grains Reveals Ultra-Fast Decay Component
- FLIM at a Time-Channel Width of 300 Femtoseconds
- Ultra-Fast Fluorescence Decay in Scottish Whisky
- Ultra-Fast Fluorescence Decay in Natural Carotenoids
- Ultra-Fast Fluorescence Decay in Malignant Melanoma
- Label-Free Multiphoton FLIM of Moving Bacteria
- Megapixel FLIM with bh TCSPC Modules – The New SPCM 64-bit Software
- New SPCImage Version Combines Time-Domain Analysis with Phasor Plot
- High-Resolution Multiphoton FLIM Reveals Ultra-Fast Fluorescence Decay in Human Hair
- Two-Photon FLIM System with a Small Femtosecond Fibre Laser
- Metabolic FLIM with Simultaneous pH Imaging
原则
多光子激发
多光子激发利用两个或多个激发光的光子来激发一个荧光光子，见下图左侧。要使这一过程达到明显的效率，需要极高的空间和时间功率密度。使用飞秒脉冲并通过高纳秒显微镜物镜聚焦，就能实现这两点，见下图（右）。脉冲持续时间为 100 fs，重复频率为 80 MHz，通过 NA = 1.3 的镜头聚焦，不需要超过 5 mW 就能获得显微镜中使用的大多数荧光染料的明亮荧光。在大多数情况下，"多光子 "激发只需使用两个光子。要获得可见光区域的荧光，激光波长必须在近红外（NIR）区域。钛：萨激光器、OPO 和飞秒光纤激光器可用于产生所需的激发波长。
与单光子激发相比，多光子激发有许多优点。
首先，样品在激发波长处的吸收率较低。此外，散射系数也低于可见光或紫外线波长。因此，双光子（或一般情况下的多光子）激发比单光子激发更深入组织，见下图左右两侧。因此，多光子激发可用于激发生物组织深层的荧光。
其次，激发被限制在功率密度较高的焦点体积内。在扫描系统中，这自动意味着激发被限制在焦平面内。这意味着无需共焦针孔来阻挡焦平面以外的光线。多光子激发本质上提供了焦外抑制功能，因此也提供了光学切片能力。
多光子激发不会激发焦平面外的荧光，这一事实带来了多光子激发的第三个优势，即检测样品内部的散射光。来自深焦平面的可见光在流出样品的过程中会发生大量散射，见下图左侧。这种光无法准直，因此无法聚焦到共聚焦针孔中。但是，没有必要通过扫描仪和针孔将光线送回。取而代之的是，光线可以直接从显微镜镜头后方转向探测器。通过投射显微镜镜头的图像（而不是样品中的图像平面），散射光子的大部分会被传送到检测器。这一原理被称为非扫描探测，见下图右侧。
与 bh TCSPC FLIM 系统结合使用的第四个优势是极高的时间分辨率。激发脉冲具有飞秒脉冲宽度。因此，FLIM 系统的仪器响应函数（IRF）不会因激发脉冲而变宽。利用快速混合探测器，IRF 宽度可低至 20 ps (fwhm)。直接记录超快荧光衰减现象的能力为 FLIM 应用开辟了一个全新的领域。请参阅有关蘑菇孢子和花粉粒中的超快衰减及其在亚 10 ps 范围内的测量的应用说明。
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